Resultatene i dette prosjektet viser at når melaninprevalensen fremstilles per fiskegenerasjon, får en et mer nyansert bildet av utviklingen av flekker i tid da en fiskegenerasjon kan slaktes over to forskjellige kalenderår. Det å strukturere melaninprevalensen per fiskegenerasjon er også nødvendig i epidemiologisk studier som skal indentifisere risikofaktorer for tilstedeværelse av flekker da produksjonsdata er strukturert per fiskegenerasjon. 

Fordelingen av prevalensen av melaninflekker i datasettene var forskjellig (datasett A og B vs datasett C) og mellom slaktepartier fra samme merd. Dette kan trolig forklares med ulik metode for registrering av melaninflekker, opplæring og oppfølgning av personellet som registrerer flekker, hvilke fisk som selekteres til filétering og med varierende produksjonsmål på slakteriene. Datasett A og B brukte den nasjonale FHF-standarden for å registrere flekker mens datasett C brukte en ja/nei-metode. Den nasjonale FHF-standarden er detaljert og dette påvirker trolig krav til opplæring og fokus hos personellet som utfører registreringene og kan igjen påvirke dataene som genereres.

Dataene på melaninprevalens og risikofaktorene (produksjonsinformasjon og sykdomsdiagnoser) i dette prosjektet er hentet inn på lokalitesnivå. Da det vil være stor variasjon mellom merder i produksjonsparametere som registreres i løpet av tiden i sjø, vil det å ha data på lokalitetsnivå redusere den statistiske styrken til resultatene i epidemiologiske studier. Ved å ha data på merdnivå kan en plukke opp enkelt hendelser/faktorer som kan forklare forskjeller i prevalensen mellom merder, mellom lokaliteter fra samme produsent, mellom forskjellige produsenter i samme geografiske område og mellom fiskegenerasjoner. 

Multivariat-analysen som ble utført i prosjektet identifiserte forskjellige risikofaktorer for prevalens av melaninflekker i laksefilét. En generell trend som kommer frem i alle datasettene er at prevalensen av flekker påvirkes av faktorer som påvirker immunresponsen til laksen, enten direkte ved virusinfeksjon eller indirekte ved bruk av systemiske helsefôr. Den positive effekten av økt andel bruk av systemiske helsefôr observert i datasett B baserer seg på grove data og må bekreftes i mer detaljerte studier. Analysene viser også en trend mot at prevalensen av flekker øker når et utsett har flere virusdiagnoser eller har en virusdiagnose i tillegg til håndteringsdødelighet. 

Konklusjon
Resultatene fra dette prosjektet gir viktig informasjon om hvordan melaninflekker bør registreres og hvordan produksjonsdata bør struktureres for å kunne brukes i epidemiologiske studier. Dette vil øke mulighetene for å identifisere risikofaktorer for melaninflekker i laksefilét og derfor bedre sjansen for å igangsette effektive preventive tiltak.

Mørke flekker er en betydelig utfordring for norsk oppdrettsnæring. I dag har hver femte fisk en eller flere mørke flekker og laksenæringen rangerer problemet som det viktigste kvalitetsavviket som må løses i fremtiden. Rund laks med mørke filetflekker har normalt utseende og kan ikke sorteres ut ved visuell bedømmelse av utsiden. Kvalitetsavviket må derved handteres av kunden dersom laksen omsettes sløyd. De fleste flekkene er 3-4cm brede, men større mørkpigmenterte områder forekommer. Tapet som bedriftene rapporterer er 5% for små flekker, mens store flekker representerer et økonomisk tap på 30-100%. De fleste flekkene sitter under bukhinnen, i tilknytning til ribbeina. De første flekkene oppstår tidlig i sjøfasen og så øker omfanget og intensiteten av flekkene mot slakt. Oppdrettsforhold, laksens helsetilstand, mekaniske skader, kjønnsmodning og fôret kan påvirke utviklingen av mørke flekker som synes å være koblet til lokale vevsskader av ukjent årsak.

 Denne presentasjonen vil gi en oversikt over nyere resultater på betydningen av fôr og forhold i tidlige livsfaser for utviklingen av mørke flekker i laksefilet.

Melaniserte fokale forandringer i hvit muskulatur er det største kvalitetsproblem ved produksjon av norsk oppdrettslaks. Utvikling av flekker har vært satt i sammenheng med infeksjon med Piscine orthoreovirus (PRV). I dette studiet har vi fulgt en populasjon av laks satt ut i et kommersielt anlegg i Hardanger. Ved utsett var det ikke påvist PRV i fisken. Det ble foretatt syv uttak fra populasjonen fra utsett til slakt. Ved hvert uttak ble 600 individer obdusert, og røde og melaniserte fokale forandringer ble registrert. Foruten representativt antall prøver fra flekker til morfologisk analyse samt fra øvrige organer ble det tatt prøver for PRV-påvisning. Etter makroskopisk alvorlighetsgrad ble forandringene klassifisert i skalaen 1 til 3.

Etter tre måneder i sjø ble det påvist PRV i fisken, først i gjeller hos noen få individer, men etter hvert i flere organer og i hele populasjonen. Prevalensen av røde fokale forandringer var lav og stabil gjennom hele forsøksperioden, men det var økning av melaniserte fokale forandringer over tid. Det ble ikke registrert alvorlige melaniserte fokale forandringer i de første uttakene, men prevalensen av disse økte mot slutten av studiet. Histologiske undersøkelser viste at slike forandringer ble dominert av granulomatøse betennelsesreaksjoner med tilstedeværelse av melanomakrofager. Mindre alvorlige forandringer var til stede ved alle uttak, men økte også utover i produksjonen. Det var stor histologisk diversitet i forandringene: Ingen registrerte histologiske forandringer; tilstedeværelse av melanomakrofager mellom myocytter; fibrose med intakte myocytter og med melanomakrofager i fibrotisk vev; og fibrose med fokale betennelsesinfiltrater. I de røde fokale forandringene ble det funnet blødninger og myocyttnekrose i varierende grad, og dette samsvarte i alvorlighetsgrad med det makroskopiske bildet.

Vi har holdepunkter for at røde fokale forandringer kan utvikle seg uavhengig PRV-status. Vi finner en overgang fra disse til melaniserte fokale forandringer. Funnene viser at innen gruppen melaniserte fokale forandringer er det svært store histologiske forskjeller. Mild grad av melaniserte fokale forandringer var også tilstede før fisken/populasjonen ble PRV-positiv. Alvorlige makroskopiske forandringer ble imidlertid alltid klassifisert som granulomatøse og alltid med tilstedeværelse av PRV.

Fokale, melaniserte muskelforandringer er hyppig forekommende i filet hos oppdrettslaks. Innledningsvis arter tilstanden seg som fokale, intramuskulære blødninger, som over tid kan utvikle seg til en kronisk og melanisert fenotype. Etiologien til tilstanden er trolig multifaktoriell, men vi har tidligere vist en assosiasjon mellom melaninflekker (og røde flekker) og in situ deteksjon av Piscint orthoreovirus-antigen (PRV). PRV sin betydning for dannelsen av svarte flekker er uavklart, men persistens av virus er trolig av sentral betydning i utviklingen av en kronisk, melanisert betennelsestilstand.

 I dette studiet ble immunreaksjonen i røde flekker (n=6) undersøkt ved bruk av immunhistokjemi (IHC) med markører for diverse immunceller. Prøvene ble også undersøkt med IHC for replikasjons-markøren μNS, et intermediært ikke-strukturelt protein, som kun uttrykkes ved virusreplikasjon. Det ble også gjort RT-qPCR for enkelte immungener. Resultatene ble sammenliknet med klassiske melaninflekker (n=6). Uaffisert kontrollmuskulatur ble benyttet som kontrollvev for hver enkelt flekk. IHC-resultatene ble vurdert på en semi-kvantitativ skala fra 0-3 (0 – ingen, 1 – få, 2 – noen og 3 – mange.

Alle forandringene var positive for PRV, både med IHC (score 2-3) og RT-qPCR. μNS-positive celler ble funnet i samtlige forandringer (score 2-3). Ingen andre infeksiøse agens ble detektert, hverken med PCR-screening for ulike virus eller med spesialfarginger for bakterier og sopp. Betennelsescelleinfiltrater ble funnet i alle undersøkte flekker. Disse var dominert av store mengder MHC klasse I og II-positive celler (score 2-3). Antall CD3-positive celler varierte fra svært få til mange, men var alltid til stede. Mengden CD8-positive celler var generelt varierende; fra ingen i to individer til store mengder (score 3) i ett individ. RT-qPCR data viste en økning i genuttrykk i de røde flekkene (sammenliknet med uaffisert muskulatur) for CD4, MHC- I, TNFα, IL1b, Viperin and Mx 1. Apoptose-markøren Caspase-3 var oppregulert i alle røde flekker. IL10 var kraftig nedregulert i samtlige røde flekker, mens en beskjeden oppregulering ble observert i svarte flekker. 

Resultatene drøftes opp mot PRVs rolle i utviklingen av svarte flekker

Fiskeskinn er i direkte kontakt med det varierende ytre miljøet. Det er essensielt at dette vevet er robust og intakt, og kan opprettholde normal funksjon og helse under varierende miljøpåvirkning og håndtering, for eksempel i forbindelse med avlusing. Med sin kobling til ryggbeinet via myosepta, spiller skinnet også en viktig rolle for svømmemekanismen til fisken. 

For å forstå hvordan kvaliteten på fiskeskinn påvirkes av endringer av fôrresepten, miljø med mere, må man kunne måle dette. I dag finnes ingen metode for å objektivt kunne måle styrken til skinnet. Derfor har vi utviklet en instrumentell metode for dette formålet. Med denne nye metoden er det mulig dokumentere hvordan skinnkvaliteten påvirkes av endringer i ernæring og utfordrende miljøforhold, og ikke minst objektivt definere tiltak som kan forbedre fiskens skinnkvalitet. 

Denne presentasjonen fokuserer på å beskrive den nyutviklede metoden. Instrumentet som benyttes brukes normalt til analyser av mekanisk styrke av diverse materialer (5940 Single Column Tabletop Testing Systems, Instron, Norwood, MA, USA). Metoden eksemplifiseres ved bl.a. sammenligning av skinnstyrke på laks og ørret, der ørreten hadde betydelig sterkere skinn enn laks (bruddstyrke 215 vs 111 Newton). Resultater ved bruk av metoden på oppdrettslaks fra kontrollerte fôringsforsøk (ulike nivåer av fett og fettsyrer) blir også presentert.